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Jan 05, 2024

Microbioma de ensilajes de granos de maíz y sorgo rehidratados tratados con inoculantes microbianos en diferentes períodos de fermentación

Scientific Reports volumen 12, número de artículo: 16864 (2022) Cite este artículo 1331 Accesos 5 Citas 6 Detalles de métricas altmétricas Debido a las intrincadas relaciones coevolucionadas y la influencia mutua

Scientific Reports volumen 12, número de artículo: 16864 (2022) Citar este artículo

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5 citas

6 altmétrico

Detalles de métricas

Debido a las intrincadas relaciones coevolucionadas y la influencia mutua entre los cambios en el microbioma y la calidad de la fermentación del ensilaje, exploramos los efectos de los inoculantes Lactobacillus plantarum y Propionibacterium acidipropionici (Inoc1) o Lactobacillus buchneri (Inoc2) sobre la diversidad y la sucesión de comunidades bacterianas y fúngicas. de granos rehidratados de maíz (CG) y sorgo (SG) y sus ensilajes mediante secuenciación Illumina Miseq después de 0, 3, 7, 21, 90 y 360 días de fermentación. Los efectos de los inoculantes sobre la sucesión bacteriana y fúngica difirieron entre los granos. Las especies Lactobacillus y Weissella fueron las principales bacterias involucradas en la fermentación del ensilaje de granos de maíz y sorgo rehidratados. Aspergillus spp. El moho fue predominante en la fermentación CG rehidratada, mientras que la levadura Wickerhamomyces anomalus fue el hongo principal en los ensilajes SG rehidratados. El Inoc1 fue más eficiente que CTRL e Inoc2 para promover el fuerte crecimiento de Lactobacillus spp. y mantener la estabilidad de la comunidad bacteriana durante largos períodos de almacenamiento en ambos ensilajes de granos. Sin embargo, las comunidades bacterianas y fúngicas de los ensilajes de maíz y sorgo rehidratados no permanecieron estables después de 360 ​​días de almacenamiento.

Los granos de maíz y sorgo se han utilizado en concentrados ofrecidos a rumiantes para proporcionarles energía principalmente a partir de su contenido de almidón1. El endospermo del grano contiene la mayor cantidad de almidón y determina el valor económico y nutricional del grano porque la estructura y composición del almidón y su interacción física con la proteína del grano pueden alterar su digestibilidad2. El efecto del endospermo sobre la digestibilidad puede manipularse mediante el procesamiento del grano3. El ensilaje de granos rehidratados es una técnica prometedora para mejorar el valor nutritivo de los granos4, y entre los granos, el sorgo tiene la mayor ganancia en digestibilidad después de este proceso, seguido por el grano de maíz y otros cereales5.

Durante el proceso de ensilado, el aumento en la digestibilidad del almidón del grano puede deberse a la degradación parcial de la matriz hidrófoba de almidón-proteína que rodea los gránulos de almidón por proteólisis6, lo que resulta en una mayor solubilización de prolamina y un aumento de la superficie de los gránulos de almidón para un posible ataque de las bacterias del rumen7.

Los estudios han demostrado que las condiciones climáticas afectan todas las etapas de la producción y utilización del ensilaje, especialmente en áreas cálidas y húmedas, porque la proliferación microbiana está fuertemente influenciada por la temperatura8. Estos factores climáticos no sólo afectan el crecimiento de los cultivos forrajeros y la incidencia de enfermedades, sino que también influyen en la fermentación del ensilaje y la estabilidad aeróbica9.

Se ha informado que Lactobacillus plantarum es el inoculante de ensilaje más utilizado10. Esta especie produce ácido láctico, que reduce rápidamente el pH y mejora la fermentación11. Sin embargo, se han perdido grandes cantidades de ensilaje y el costo de producción puede sufrir consecuencias negativas debido al deterioro aeróbico; por lo tanto, se han estudiado bacterias propiónicas y bacterias heterofermentativas productoras de acetato para reducir el deterioro de los ensilajes después de la exposición al aire4,12.

La inoculación bacteriana puede influir en las características de fermentación y el valor nutricional del ensilaje de manera diferente dependiendo de las bacterias epífitas presentes en la materia prima13 y las cepas en los diferentes materiales de ensilaje14. Según Si et al.13, el ensilaje y su microbiota han coevolucionado relaciones intrincadas, y existe una influencia mutua entre los cambios en el microbioma y los parámetros de fermentación del ensilaje, como la correlación positiva entre Lactobacillus plantarum y el contenido de ácido láctico. Generalmente, la composición de los microorganismos antes y después del ensilaje sufre cambios significativos15. Monitorear estos cambios durante el ensilado sería útil para comprender y mejorar a fondo el proceso de ensilado16.

Recientemente, se han utilizado métodos moleculares para evaluar la calidad, actividad y dinámica de una compleja comunidad de microorganismos involucrados en la conservación de forrajes17,18,19, evitando subestimar la diversidad microbiana de los ensilajes20. A pesar del potencial de los ensilajes de granos rehidratados y del hecho de que los microorganismos asociados al ensilaje pueden afectar significativamente la calidad del ensilaje y la salud de los rumiantes, pocos estudios han evaluado la población microbiana y su dinámica durante el proceso de fermentación de los granos de maíz y sorgo rehidratados, particularmente utilizando los de próxima generación. secuenciación.

En este contexto, esperando un cambio rápido en el ambiente del ensilaje y diferentes efectos de los inoculantes microbianos en el microbioma de los ensilajes, exploramos la sucesión de poblaciones de bacterias y hongos, identificamos los microorganismos dominantes involucrados en el ensilaje y evaluamos el impacto de los inoculantes microbianos en la comunidad epífita de granos de maíz y sorgo rehidratados y sus ensilajes después de 0, 3, 7, 21, 90 y 360 días de fermentación.

El experimento se realizó entre enero de 2016 y enero de 2017 en el Departamento de Ciencia Animal de la Universidad Federal de Vicosa (Viçosa, MG, Brasil), ubicado a 20° 45′ S, 42° 52′ W, 663 m sobre el nivel del mar. La precipitación anual y la temperatura promedio durante el año del experimento fueron 1235,4 mm y 20,7 °C, respectivamente.

Las muestras utilizadas en este experimento se obtuvieron de un estudio previo realizado por21 (datos no publicados), quienes evaluaron los efectos del inoculante microbiano y la duración del período de fermentación en ensilajes de granos de maíz y sorgo rehidratados. El presente estudio cumple con las normas éticas brasileñas. Todos los métodos se realizaron de acuerdo con las directrices y regulaciones pertinentes. Brevemente, el experimento se llevó a cabo bajo un diseño completamente al azar (con tres repeticiones) basado en un ensayo factorial 2 × 3 × 6, con dos granos (maíz-CG y sorgo-SG), tres inoculantes y seis períodos de fermentación (0 , 3, 7, 21, 90 y 360 días). Los tratamientos evaluados fueron maíz control (CG-CTRL), maíz Lalsil Milho (CG-Inoc1), maíz Lalsil AS (CG-Inoc2), sorgo control (SG-CTRL), sorgo Lalsil Milho (SG-Inoc1) y sorgo Lalsil. AS (SG-Inoc2). Los inoculantes estuvieron compuestos por CTRL—no inoculado; Inoc1: Lactobacillus plantarum > 3,0 × 1010 UFC g-1, Propionibacterium acidipropionici > 3,0 × 1010 UFC g-1 y sacarosa (Lalsil Milho, Lallemand Animal Nutrition); Inoc2: Lactobacillus buchneri CNCM-I 4323 1,0 × 1011 UFC g-1 y sacarosa (Lalsil AS, Lallemand Animal Nutrition) a una tasa de aplicación de 105 UFC g-1.

Los granos de maíz y sorgo de una granja local se desintegraron en gran medida en un molino equipado con tamices de malla de 3 mm. Antes de la fermentación, los granos molidos se rehidrataron (con agua) hasta un contenido de humedad del 30%. Posteriormente, los inoculantes se disolvieron en agua destilada a las dosis recomendadas por el fabricante, se pulverizaron sobre 500 g de granos rehidratados, se mezclaron uniformemente a mano, se envasaron en bolsas de film plástico (25,4 cm × 35,56 cm) y se aspiraron con selladora al vacío (Eco vacío 1040, Orved, Italia). Se aplicó la misma cantidad de agua a los ensilajes CTRL.

Las bolsas se almacenaron en el laboratorio a temperatura ambiente (rango 23-27 °C). Del total de 108 bolsas, 18 fueron abiertas a los 0, 3, 7, 21, 90 y 360 días después de la fermentación. Se prepararon muestras compuestas representativas de cada tratamiento en cada período de fermentación, totalizando seis muestras por período de fermentación y 36 muestras en total.

Las 36 muestras se trituraron en nitrógeno líquido y el ADN total se extrajo utilizando el kit de extracción de ADN NucleoSpin Soil (Macherey – Nagel, Düren, Alemania), según las recomendaciones del fabricante. El ADN se cuantificó utilizando un espectrofotómetro Nanodrop (Thermo Scientific, Waltham, EE. UU.) y se comprobó su calidad en gel de agarosa al 1,4%.

Brevemente, se produjeron bibliotecas de amplicones de PCR dirigidas al gen que codifica el ARNr 16S presente en el ADN metagenómico utilizando un conjunto de cebadores con código de barras adaptado para Illumina HiSeq2000 y MiSeq22. Posteriormente, los datos de la secuencia de ADN se generaron utilizando la secuenciación de extremos emparejados de Illumina en la Instalación de Secuenciación y Preparación de Muestras Ambientales (ESPSF) en el Laboratorio Nacional Argonne, EE. UU. Específicamente, la región V4 del gen 16S rRNA (515F-806R) se amplificó por PCR con cebadores específicos de región que incluían secuencias adaptadoras de secuenciador utilizadas en la celda de flujo de Illumina22,23.

La reacción se complementó con un bloqueador de ácido peptídico nucleico (PNA) personalizado diseñado para evitar la amplificación de secuencias contaminantes del huésped (mitocondrial o plástido). Estos bloqueadores se adhieren a las secuencias del huésped durante el proceso de PCR e impiden su amplificación24. El cebador de amplificación inversa también contenía una secuencia de código de barras de doce bases que admitía la combinación de hasta 2167 muestras diferentes en cada carril22,23.

Cada reacción de PCR de 25 µL contenía 8,5 µL de agua Mo BIO PCR (certificada sin ADN), 12,5 µL de AccuStart II ToughMix de QuantaBio (2 × concentración, 1 × final), 1 µL de cebador inverso etiquetado con código de barras Golay (concentración de 5 µM, 200 pM final), 1 µL de cebador directo (concentración de 5 µM, 200 pM final), 1 µL de bloqueador de PNA (mitocondrial o plástido, concentración de 25 µM, 1 µM final) (Lundberg et al., 2013) y 1 µL de ADN molde . Las condiciones para la PCR fueron las siguientes (Lundberg et al., 2013): 95 °C durante 45 s para desnaturalizar el ADN, seguido de 35 ciclos a 95 °C durante 15 s, 78 °C durante 10 s (para el recocido de PNA) , 50 °C durante 30 s (para el recocido del cebador) y 72 °C durante 30 s, con un enfriamiento a 4 °C una vez completado el ciclado. Los amplicones se cuantificaron utilizando PicoGreen (Invitrogen, Waltham, EE. UU.) y un lector de placas (Infinite 200 PRO, Tecan). Una vez cuantificados, los volúmenes de cada producto se combinaron en un solo tubo de modo que cada amplicón estuviera representado en cantidades equimolares. Luego, este grupo se limpió usando perlas AMPure XP (Beckman Coulter) y se cuantificó usando un fluorómetro (Qubit, Invitrogen).

Después de la cuantificación, se determinó la molaridad del conjunto, se diluyó hasta 2 nM, se desnaturalizó y luego se diluyó hasta una concentración final de 6,75 pM con una punta de PhiX al 10 % para la secuenciación con Illumina MiSeq. Los amplicones se secuenciaron en una ejecución MiSeq de 251 pb × 12 pb × 251 pb utilizando cebadores y procedimientos de secuenciación personalizados22.

Para los análisis de hongos, el ADN genómico se amplificó utilizando un conjunto de cebadores espaciadores transcritos internos (ITS) con código de barras personalizado adaptado para Illumina HiSeq2000 y MiSeq. Estos cebadores fueron diseñados por el laboratorio de Kabir Peay en la Universidad de Stanford (Plos one; Smith, Peay 2014). El cebador de amplificación inversa también contenía una secuencia de código de barras de doce bases que admitía la combinación de hasta 2167 muestras diferentes en cada carril22,25. Cada reacción de PCR de 25 µL contenía 12 µL de agua Mo BIO PCR (certificada sin ADN), 10 µL de 5 Prime HotMasterMix (1 ×), 1 µL de cebador directo (concentración de 5 µM, 200 pM final), 1 µL de código de barras Golay. cebador inverso etiquetado (concentración de 5 µM, 200 pM final) y 1 µl de ADN molde. Las condiciones para la PCR fueron las siguientes: 94 °C por 3 min para desnaturalizar el ADN, seguido de 35 ciclos a 94 °C por 45 s, 50 °C por 60 s y 72 °C por 90 s, con una extensión final. de 10 min a 72 °C para asegurar una amplificación completa. Los amplicones se cuantificaron utilizando PicoGreen (Invitrogen) y un lector de placas.

Una vez cuantificados, se combinaron diferentes volúmenes de cada producto en un solo tubo para que cada amplicón estuviera igualmente representado. Luego, este grupo se limpió con el kit de limpieza de PCR UltraClean (Mo BIO, Carlsbad, EE. UU.) y se cuantificó utilizando un Qubit (Invitrogen). Después de la cuantificación, se determinó la molaridad del conjunto, se diluyó hasta 2 nM, se desnaturalizó y luego se diluyó hasta una concentración final de 6,75 pM con una punta de PhiX al 10 % para la secuenciación con Illumina MiSeq.

Las lecturas de secuenciación sin procesar obtenidas de la secuenciación del amplicón 16S rRNA y ITS rRNA se sometieron a diferentes pasos de filtrado de calidad. Se eliminaron las secuencias que mostraban bases con un error máximo esperado de 0,05 de probabilidad y las secuencias restantes se agruparon en unidades taxonómicas operativas (OTU) utilizando el programa Usearch v.1126, con un umbral de 97% de similitud. Las quimeras se eliminaron mediante el algoritmo Uparse27. Se utilizó el programa ITSx v.1.0.1128 para eliminar secuencias ITS1 no fúngicas.

La anotación taxonómica se realizó utilizando la herramienta de búsqueda de alineación local básica (BLAST) de QIIME v.1.9.125, utilizando las bases de datos SILVA y UNITE para poblaciones bacterianas y fúngicas, respectivamente. Las secuencias contaminantes como las de cloroplasto y mitocondrias se eliminaron mediante anotaciones taxonómicas. Las métricas de diversidad alfa (riqueza de Chao1, uniformidad y diversidad de Simpson) se calcularon utilizando el software R (Versión 2.15.3).

Se probaron las distribuciones normal, Poisson, Poisson inflada, Poisson alterada en cero y Hurdle para la variable Y. Con base en el criterio de información de desviación (DIC), la distribución de Poisson se ajusta mejor a los datos.

El modelo estadístico general se proporciona a continuación:

donde \(l\) es el vector de la variable latente para el rasgo estudiado (y); \(y\) es el vector del número de hongos (o bacterias); \({y}_{i}\sim Poisson({\lambda }_{i}=\mathrm{exp}\left({l}_{i}\right))\), donde \(i=\ mathrm{1,2},\dots ,n\) y \(n\) es el número de observaciones; \(\lambda \) es el parámetro canónico de esta distribución (media de Poisson); \(\mathrm{exp}\) es la función de enlace inverso de la distribución de Poisson; \(b\) es el vector de efectos sistemáticos (media, período de fermentación y tratamiento: CTRL, Inoc1 e Inoc2); \({u}_{1}\) es el vector del efecto de las especies de tipo hongo (o bacteria); \({u}_{2}\) es el vector para la interacción del tipo de hongo (o bacteria) y el efecto del período de fermentación; \({u}_{3}\) es el vector de interacción del tipo de hongo (o bacteria) y el efecto del inoculante; \({u}_{4}\) es el vector para la interacción del tipo de hongo (o bacteria), el período de fermentación y el efecto del inoculante. Así, se definió que el vector de la variable latente asume una distribución normal multivariada dada por \(l|b,{u}_{1},{u}_{2},{u}_{3},{ u}_{4},{\sigma }_{1}^{2},{\sigma }_{2}^{2},{\sigma }_{3}^{2},{\sigma } _{4}^{2},{\sigma }_{e}^{2}\sim N(Xb+{Z}_{1}{u}_{1}+{Z}_{2}{u }_{2}+{Z}_{3}{u}_{3}+{Z}_{4}{u}_{4}, I{\sigma }_{e}^{2}) \), donde \({\sigma }_{1}^{2},{\sigma }_{2}^{2},{\sigma }_{3}^{2},{\sigma }_ {4}^{2}\) y \({\sigma }_{e}^{2}\) son los componentes de la varianza asociados con \({u}_{1}, {u}_{2}\ ), \({u}_{3}, {u}_{4}\) y \(e\) (varianza del error), respectivamente.

Las distribuciones previas asumidas para los parámetros del modelo fueron:

Las distribuciones previas asumidas para los componentes de la varianza fueron:

donde IG es la distribución gamma inversa, \({\alpha }_{1}\), \({\beta }_{1}\), \({\alpha }_{2}\), \( {\beta }_{2}\), \({\alpha }_{3}\), \({\beta }_{3}\), \({\alpha }_{4}\), \({\beta }_{4},{\alpha }_{e}\), igual a \(0.001\) y \({\beta }_{e}\) son constantes conocidas llamadas hiperparámetros iguales a \({10}^{8}.\)

La inferencia estadística de los parámetros de (\(b,{u}_{1},{u}_{2},{u}_{3},{u}_{4},{\sigma }_{ 1}^{2},{\sigma }_{2}^{2},{\sigma }_{3}^{2},{\sigma }_{4}^{2},{\sigma } _{e}^{2}\)) se basó en distribuciones marginales posteriores. En resumen, se generaron indirectamente muestras aleatorias de las distribuciones marginales posteriores a partir de las distribuciones posteriores condicionales completas (fcpd) (función de probabilidad × la distribución previa de cada parámetro) a través de algoritmos Monte Carlo de cadena de Markov (MCMC). Si fcpd se caracteriza como una familia conocida de distribuciones de probabilidad, se puede utilizar el muestreador de Gibbs. Por lo tanto, después de un número suficientemente grande de iteraciones, los valores generados a partir de fcpd fueron muestras de distribuciones marginales posteriores.

En el análisis, utilizamos 2.000.000 de iteraciones de los algoritmos MCMC para la obtención previa de diferentes procedimientos, y las primeras 100.000 iteraciones se descartaron como burn-in. Después de la realización de cada conjunto de diez iteraciones (delgadas), se retuvo una muestra para calcular las estadísticas posteriores. La convergencia de la cadena de Markov se verificó mediante el diagnóstico de Geweke29.

Al realizar estos análisis, fue posible verificar qué efectos fueron importantes para la incidencia de hongos y bacterias en granos de maíz y sorgo. Se eligió el modelo con el DIC más pequeño; por lo tanto, esos efectos se consideraron relevantes para explicar la variable de interés (Tabla complementaria S1). Si se detectó interacción entre el tipo de inoculante y el período de fermentación, se estudió cada factor dentro del otro. Así, la diferencia entre los niveles se detectó a través del intervalo de credibilidad.

La composición química, el pH y las poblaciones microbianas de los granos de maíz y sorgo molidos y rehidratados se muestran en la Tabla 1. El perfil de fermentación promedio y la población microbiana de los ensilajes de granos de maíz y sorgo rehidratados se presentan en la Tabla complementaria S2.

Se generaron un total de 1.581.953 lecturas de alta calidad, de las cuales 783.146 se originaron en las muestras de CG y 798.807 lecturas se originaron en SG en diferentes días de fermentación. El número de secuencias se estandarizó en relación con el número mínimo de 12.297 secuencias obtenidas de una sola muestra. Las comunidades bacterianas en muestras de CG y SG se presentan en las Tablas complementarias S3 y S4, respectivamente. Se detectaron un total de 257 y 119 OTU en muestras de CG y SG, respectivamente. Las curvas de rarefacción de OTU con una identidad de secuencia del 97% se muestran en la Figura complementaria S1. La profundidad de la secuenciación fue suficiente para describir completamente la diversidad de las poblaciones bacterianas en los ensilajes a medida que las curvas de rarefacción alcanzaron una meseta para las secuencias.

El índice de diversidad de Simpson de los ensilajes de granos de maíz y sorgo rehidratados se muestra en la Fig. 1. La diversidad inicial del CG fue similar entre los tratamientos. Hubo una reducción en la diversidad durante el período de fermentación, principalmente para los ensilajes CG-Inoc1, debido a la menor uniformidad en estos ensilajes, ya que la riqueza de Chao 1 disminuyó en los 3 días y se mantuvo similar entre los tratamientos hasta el final de la fermentación. período. La diversidad de CG a los 360 días aumentó, acercándose a los valores iniciales.

Chao 1 Riqueza, uniformidad y diversidad Simpson de ensilajes de granos de maíz y sorgo rehidratados durante todo el período de fermentación (0, 3, 7, 21, 90 y 360 días). CTRL no inoculado, Inoc1 Lactobacillus plantarum y Propionibacterium acidipropionici, Inoc2 Lactobacillus buchneri.

Numéricamente, las muestras SG tuvieron un índice de diversidad inicial más bajo que las muestras CG, y el índice de diversidad aumentó desde el día 3 en adelante. Las respuestas de diversidad de los ensilajes en los diferentes tratamientos fueron similares, excepto en SG-Inoc1, que tuvo números iniciales más bajos y valores reducidos después de 90 días de fermentación debido a la reducción de la uniformidad.

Comparando el efecto de la inoculación sobre la abundancia bacteriana dentro de cada período de fermentación (Tabla 2), según las estimaciones del modelo de Poisson, la mayor abundancia bacteriana se encontró en los ensilajes CG-CTRL en los días 0, 7 y 90 de fermentación; sin embargo, el valor más bajo se observó para estos ensilajes después de 21 días de fermentación. No se encontraron diferencias entre los inoculantes después de 360 ​​días de fermentación. Para los ensilajes SG, la inoculación promovió diferencias en la abundancia bacteriana solo en el día 0 de fermentación, lo que resultó en ensilajes SG-Inoc2 con mayor abundancia y SG-CTRL con valores intermedios, seguidos de ensilajes SG-Inoc1.

El análisis del comportamiento de la abundancia bacteriana durante el período de fermentación para cada inoculación (Tabla 3) reveló diferencias en la abundancia bacteriana a lo largo del período de fermentación para todos los inoculantes en ambos ensilajes de granos. La abundancia de ensilajes SG fue mayor en los materiales no fermentados (día 0) que en otros, independientemente de la inoculación, mientras que en los ensilajes CG no se observó un patrón.

Los análisis de la abundancia relativa de comunidades bacterianas revelaron la presencia de nueve y seis filos en CG y SG, respectivamente (Figura complementaria S2). En ambos granos se encontraron los filos Actinobacteria, Bacteroides, Deinococcus-Thermus, Firmicutes y Proteobacteria. El filo Cyanobacteria se encontró en SG, y Acidobacteria, Chloroflexi, Planctomycetes y Verrucomicrobia se encontraron solo en muestras de CG.

El predominio (>80%) de Proteobacterias se observó en ambos granos al inicio de la fermentación (día 0), excepto en CG-CTRL y CG-Inoc1, que tuvieron 51% de Proteobacterias y 61% de Actinobacterias, respectivamente. En todos los ensilajes de CG, el filo Firmicutes dominó (>84%) la fermentación de 3 a 90 días después del ensilaje. Hubo una tendencia en la comunidad bacteriana a volver a su diversidad inicial a los 360 días de fermentación, con la sustitución de Firmicutes por Proteobacteria y Actinobacteria.

Como se observó para los filos, el número de clases bacterianas encontradas en las muestras de CG fue mayor que en las muestras de SG (16 frente a 9) (Fig. 2). Las clases Actinobacteria, Alphaproteobacteria, Bacilli, Bacteroidia, Clostridia, Deinococci, Erysipelotrichia y Gammaproteobacteria se encontraron comúnmente en ambos granos. Oxyphotobacteria estuvo presente solo en SG, mientras que Acidobacteria, Deltaproteobacteria, Negativicutes, Planctomycetacia, Rubrobacteria, Thermoleophilia, TK10 y Verrucomicrobiae se encontraron solo en muestras de CG. Las clases Bacilli y Gammaproteobacteria fueron los principales representantes de los filos Firmicutes y Proteobacteria, respectivamente. Durante el período de fermentación, los cambios observados en estos dos filos principales fueron principalmente el resultado del aumento o reducción del número de estas dos clases.

Clases de perfiles taxonómicos de comunidades bacterianas de ensilajes de granos de maíz y sorgo rehidratados después de 0, 3, 7, 21, 90 y 360 días de fermentación. CTRL no inoculado, Inoc1 Lactobacillus plantarum y Propionibacterium acidipropionici, Inoc2 Lactobacillus buchneri.

Ambos inoculantes microbianos favorecieron el crecimiento de bacilos en ensilajes CG y SG; sin embargo, las bacterias presentes en Inoc1 fueron más efectivas para promover cambios en la población bacteriana de ambos ensilajes de granos ya en el tercer día de fermentación.

La dinámica de los principales géneros en los ensilajes CG se presenta en la Fig. 3. Aunque la clase Bacilli se encontró predominantemente en ambos granos durante los períodos intermedios de fermentación, la sucesión de los géneros que representan esta clase se distinguió entre los ensilajes. La composición de género inicial del GC fue desigual entre los tratamientos. En el CS-CTRL, la fermentación a partir del 3er día fue predominantemente por Weissela, con reemplazo paulatino por el género Lactobacillus, que representó el 93% de los géneros a los 90 días. Las bacterias en Inoc1 indujeron el predominio (>80%) de Lactobacillus de 3 a 90 días de fermentación.

Dinámica de los principales géneros (%) de comunidades bacterianas de ensilajes de granos de maíz rehidratados después de 0, 3, 7, 21, 90 y 360 días de fermentación. CTRL no inoculado, Inoc1 Lactobacillus plantarum y Propionibacterium acidipropionici, Inoc2 Lactobacillus buchneri.

Aunque Lactobacillus representó ≅ 90% de las bacterias en CS-Inoc2 a los 21 y 90 días, el inoculante no fue tan eficiente como Inoc1 para prevenir el desarrollo de Weissella y otros géneros a los 3 días y 7 días de fermentación. Se observó una mayor uniformidad en los ensilajes de todos los tratamientos a los 360 días, resultando en la sustitución de Lactobacillus. Los ensilajes CS-Inoc1 tuvieron los mayores recuentos de Lactobacillus (50%), evidenciando la mayor eficiencia de Inoc1 para mantener el equilibrio de la población bacteriana en el último período evaluado. Los ensilajes de CS-Inoc2 fueron los que mayoritariamente tendieron a regresar al perfil poblacional inicial, con una abundancia relativa del 32% para Acinetobacter y del 37% para otros géneros.

La dinámica del perfil de géneros en los ensilajes SG se muestra en la Fig. 4. Los cambios en la comunidad bacteriana en los ensilajes SG inoculados fueron más complejos que los de los ensilajes CG, lo que indica interacciones más complicadas entre la flora bacteriana. A diferencia de CG, cuyas poblaciones iniciales eran heterogéneas, SG tuvo menor riqueza y uniformidad inicial, lo que reflejó el predominio (51-80%) del género Pantoea, principalmente en los ensilajes de SG-Inoc1 (80%). A lo largo del período de fermentación, se produjeron sustituciones de género graduales, pero no totales, por diferentes proporciones de Weissella, Lactobacillus y bacterias pertenecientes a la familia Enterobacteriaceae.

Dinámica de los principales géneros (%) de comunidades bacterianas de ensilajes de granos de sorgo rehidratados después de 0, 3, 7, 21, 90 y 360 días de fermentación. CTRL no inoculado, Inoc1: Lactobacillus plantarum y Propionibacterium acidipropionici, Inoc2 Lactobacillus buchneri.

El reemplazo bacteriano fue menos pronunciado en los ensilajes SG que en los ensilados CG durante el período de fermentación. Un alto porcentaje (> 85%) de Lactobacillus, como se observó en CG-Inoc1 durante las etapas iniciales de la fermentación, ocurrió solo en los ensilajes de SG-Inoc1 a partir de los 90 días. SG-Inoc2 tuvo una sucesión bacteriana similar a SG-CTRL a partir de los 90 días, con presencia de diferentes géneros en la comunidad bacteriana. Como se observó en CG a los 360 días, hubo cambios en la composición taxonómica bacteriana, principalmente el reemplazo de Lactobacillus por Weissella en ensilajes SG-CTRL y Weissella y Kosakonia en SG-Inoc2. Sin embargo, los cambios en SG fueron principalmente a nivel familiar, mientras que en los ensilajes CG también se observaron sustituciones a nivel de phylum. La muestra SG-Inoc1 presentó la mayor estabilidad de la composición bacteriana a los 360 días, con un 93% representado por Lactobacillus.

En total, se obtuvieron 2.569.416 lecturas de alta calidad, de las cuales 1.587.182 lecturas y 982.334 lecturas se originaron a partir de muestras de CG y SG, respectivamente, en diferentes días de fermentación. La calidad de las secuencias presentes en SG-Inoc2 a los 360 días fue insuficiente para identificar la comunidad fúngica. El número de secuencias se estandarizó en relación con el número mínimo de 2863 secuencias obtenidas de una sola muestra.

Las comunidades de hongos en CG y SG se presentan en las Tablas complementarias S5 y S6, respectivamente. Se detectaron un total de 71 y 109 OTU en muestras de CG y SG, respectivamente. Las curvas de rarefacción de OTU con una identidad de secuencia del 97% se muestran en la Figura complementaria S3. La profundidad de la secuenciación fue suficiente para describir completamente la diversidad de las poblaciones de hongos en los ensilajes, ya que las curvas de rarefacción alcanzaron una meseta clara para las secuencias.

El índice de diversidad de Simpson de los ensilajes de granos de maíz y sorgo se muestra en la Fig. 5. Hubo fluctuaciones en la diversidad del micobioma durante todo el período de fermentación en todos los tratamientos. Numéricamente, el ensilaje CG-Inoc1 tuvo menor diversidad al inicio de la fermentación que otros ensilajes CG. A los 90 días, hubo una caída en la diversidad de todos los tratamientos, que luego aumentó nuevamente después de 360 ​​días, principalmente debido a la variación en la uniformidad. En general, la diversidad de las muestras del SG fue mayor que la de las muestras del CG. Como se observó en CG a los 90 días, hubo una reducción en la diversidad en todos los tratamientos con SG, especialmente en el ensilaje SG-Inoc2, que volvió a aumentar después de 360 ​​días de fermentación.

Fungal Chao 1 Riqueza, uniformidad, diversidad Simpson de ensilajes de granos de maíz y sorgo rehidratados durante todo el período de fermentación (0, 3, 7, 21, 90 y 360 días). CTRL no inoculado, Inoc1 Lactobacillus plantarum y Propionibacterium acidipropionici, Inoc2 Lactobacillus buchneri.

De acuerdo con las estimaciones del modelo de Poisson, al analizar el efecto de los inoculantes sobre la abundancia de hongos dentro de cada período de fermentación (Cuadro 4), los valores más altos se observaron para los ensilajes CG-CTRL, y los valores más bajos se observaron para los ensilajes CG-Inoc2 después de 0 días y 3 días de fermentación. Sin embargo, no se observaron diferencias en los otros períodos de fermentación, y no se observó ninguna diferencia en la abundancia de hongos de los ensilajes SG a los 0 días y a los 360 días de fermentación. Sin embargo, los ensilajes SG-Inoc1 mostraron los valores más altos después de 3 y 21 días de fermentación. Las abundancias más bajas se observaron en los ensilajes SG-CTRL y SG-Inoc2 los días 7 y 90, respectivamente.

Los efectos de cada inoculación sobre la abundancia de hongos durante el período de fermentación en ambos granos se muestran en la Tabla 5. La abundancia de hongos no difirió entre los ensilajes CG-Inoc1, CG-Inoc2, SG-CTRL y SG-Inoc1 y disminuyó en CG-CTRL. y ensilajes SG-Inoc2 durante todo el período de fermentación.

En ambos cereales se encontraron los filos Ascomycota, Basidiomycota y Mucoromycota. Ascomycota predominó en todas las muestras, con pocas variaciones en la presencia de los otros filos (Figura complementaria S4).

En ambos granos se encontraron hongos no identificados y las otras once clases (Fig. 6). Las clases Agaricomycetes, Dothideomycetes, Eurotiomycetes, Microbotryomycetes, Mucoromycetes, Saccharomycetes, Sordariomycetes, Tremellomycetes y Wallemiomycetes se encontraron en ambos granos, mientras que Orbiliomycetes y Pezizomycetes se encontraron solo en muestras de CG, y Agaricostilbomycetes y Cystobasidiomycetes se encontraron en muestras de SG. Los saccharomycetes y eurotiomycetes se encontraron predominantemente en CG, mientras que los dothideomycetes y saccharomycetes fueron las principales clases encontradas en la fermentación fúngica de SG. En los ensilajes CG-CTRL y CG-Inoc2, aproximadamente la mitad de las poblaciones iniciales eran microorganismos pertenecientes a la clase Eurotiomycetes, con proporciones menores de Sordariomycetes y Tremellomycetes. Al día 3 de fermentación hubo un gran aumento de Saccharomycetes en ambos ensilajes, con reemplazo paulatino por Eurotiomycetes, cuyo predominio (>80%) se extendió hasta los 360 días. Los dothideomicetes representaron entre el 56% y el 92% de la población inicial en muestras de SG. Los tremelomicetos también estuvieron presentes en cantidades significativas antes de la fermentación en el ensilaje SG-Inoc1. Las poblaciones iniciales fueron reemplazadas por Saccharomycetes, con dominancia que se extendió hasta 90 días en todos los ensilajes. A los 360 días, cantidades influyentes de Eurotiomicetos reemplazaron a los microorganismos Saccharomycetes en los ensilajes SG-CTRL y SG-Inoc1.

Perfiles taxonómicos de clase de comunidades fúngicas de ensilajes de granos de maíz y sorgo rehidratados después de 0, 3, 7, 21, 90 y 360 días de fermentación. CTR no inoculado, Inoc1 Lactobacillus plantarum y Propionibacterium acidipropionici, Inoc2 Lactobacillus buchneri.

La dinámica de los principales géneros de ensilajes de granos de maíz se muestra en la Fig. 7. Aspergillus spp. representó entre el 51% y el 89% de la población inicial en muestras de CG. Su predominio (89%) en el ensilaje CG-Inoc1 a los 0 días resultó en la diversidad inicial más baja en estos ensilajes y también fue responsable de la fuerte reducción en la diversidad en todos los ensilajes CG a los 90 días. En los ensilajes CG-CTRL, tan pronto como 3 días después de la fermentación, hubo un crecimiento de levaduras Wickerhamomyces (60%) que dominaron la fermentación hasta los 21 días. Aspergillus volvió a dominar desde los 90 días hasta el final de la fermentación. Una respuesta similar se observó en el ensilaje CG-Inoc2; sin embargo, Aspergillus ya representaba el 54% y el 88% de los géneros a los 7 y 21 días, respectivamente. Las bacterias presentes en Inoc1 dieron como resultado una fermentación con predominio de Aspergillus hasta por 90 días. Sin embargo, a los 360 días, el 86% de los géneros estaban representados exclusivamente por levaduras no identificadas pertenecientes a Saccharomycetales.

Dinámica de los principales géneros (%) de comunidades fúngicas de ensilajes de granos de maíz rehidratados después de 0, 3, 7, 21, 90 y 360 días de fermentación. CTRL no inoculado, Inoc1 Lactobacillus plantarum y Propionibacterium acidipropionici, Inoc2 Lactobacillus buchneri.

La dinámica de los principales géneros de los ensilajes de grano de sorgo se muestra en la Fig. 8. Se observó una mayor participación de diferentes géneros en las muestras iniciales del SG que en las muestras del CG. Alternaria spp. representó entre el 30% y el 60% de la población inicial de los ensilajes. Además, se observaron mayores cantidades de hongos no identificados pertenecientes al orden Pleosporales, principalmente en muestras de SG-Inoc2 (60%). Wickerhamomyces anomalus predominó la población de todos los ensilajes en períodos intermedios de fermentación, con una pequeña participación de otros géneros. Como se observó anteriormente, la diversidad de los ensilajes SG-CTRL y SG-LM a los 360 días aumentó debido al aumento de los valores de uniformidad, lo que refleja la mayor participación de otros géneros, como Monascus, Candida y Aspergillus, durante la fermentación del ensilaje.

Dinámica de los principales géneros (%) de comunidades fúngicas de ensilajes de granos de sorgo rehidratados después de 0, 3, 7, 21, 90 y 360 días de fermentación. CTRL no inoculado, Inoc1 Lactobacillus plantarum y Propionibacterium acidipropionici, Inoc2 Lactobacillus buchneri.

Algunas OTU en muestras SG se clasificaron a nivel de especie e incluyeron Amylostereum chailletii, Aspergillus flavus, Exserohilum turcicum, Hyphoderma setigerum, Kwoniella heveanensis, Kwoniella mangroveensis, Monascus purpureus, Mucor circinelloides, Nigrospora oryzae, Phialemoniopsis curvata, Resinicium saccharicola, Rhizopus arrhizus, Rho. dotorula diobovata, Rhodotorula mucilaginosa, Schizophyllum commune, Setophoma sacchari, Sterigmatomyces halophilus, Strelitziana eucalypti, Wallemia ichthyophaga, W. anomalus, Xeromyces bisporus y Zygoascus hellenicus.

Las comunidades bacterianas iniciales similares en SG reflejaron el impacto inmediato mínimo de los tratamientos en la comunidad microbiana al inicio del curso temporal y la ausencia de diferencias significativas en los contaminantes microbianos exógenos que podrían alterar la composición microbiana30. El predominio de Proteobacterias en la materia prima también fue reportado por Romero et al.31 y McGarvey et al.32 en muestras de maíz y alfalfa, respectivamente. Además, la presencia de Actinobacteria en la composición inicial de CG-Inoc1 fue mucho mayor (61%) que la observada por Romero et al.31 en muestras de maíz (4,5%).

La alta abundancia de Firmicutes y la baja abundancia de Proteobacteria en ambos ensilajes de granos después de la fermentación también se observaron en avena integral marchita ensilada durante 217 días33 y ensilaje de alfalfa inoculado con diferentes inoculantes microbianos13. Por lo tanto, las condiciones ambientales durante el ensilaje contribuyen al crecimiento del filo Firmicutes14, asegurando la conservación de ensilajes de granos pequeños34.

En el ensilaje de pasto, la mayoría de las lecturas asignadas al filo Firmicutes estaban relacionadas con el orden Lactobacillales, que comprende los tres géneros más prevalentes, Lactobacillus, Lactococcus y Weissella35. En nuestro estudio, el género Acinetobacter también tuvo cantidades influyentes en el ensilaje CG-Inoc2 a los 360 días. Acinetobacter spp. son bacterias aeróbicas, no fermentadoras, que se encuentran en diferentes ambientes36. Algunas especies pueden sobrevivir en un ambiente anaeróbico en presencia de acetato como sustrato37 y requieren energía procedente de la degradación de los carbohidratos38. La mayor abundancia de Acinetobacter en el ensilaje CG-Inoc2 a los 360 días puede haber sido el resultado del aumento de la concentración de acetato producida por la cepa de L. buchneri inoculada, como se observó a los 90 días de fermentación (Tabla complementaria S2). Esto puede explicar en parte las pequeñas, aunque importantes, pérdidas de materia seca (MS) que a veces se observan en ensilajes que habían sido tratados con estas bacterias heterofermentativas durante el ensilaje39.

La reducción de la diversidad bacteriana en ensilajes CG y ensilajes SG inoculados con Inoc1 a partir de los 3 y 90 días de fermentación, respectivamente, puede explicarse por la dominancia de Lactobacillus cuando se aplicó el inoculante que contenía L. plantarum. Ogunade et al.40 también informaron una baja diversidad bacteriana resultante de la gran abundancia de Lactobacillus en ensilaje de maíz. Por tanto, cuanto más abundante es la bacteria dominante, menos diversa es la comunidad microbiana41,42. Según McDonald et al.43, después de la fermentación anaeróbica, las complejas comunidades microbianas de las materias primas son reemplazadas gradualmente por bacterias del ácido láctico (BAL), y Lactobacillus puede convertirse en un género dominante en ensilajes exitosos. De hecho, como se muestra en la Tabla 1 y en la Tabla complementaria S2, los recuentos dependientes del cultivo de LAB aumentaron y las enterobacterias y hongos se redujeron gradualmente durante el período de fermentación en todos los tratamientos.

La mayor abundancia de Lactobacillus en los ensilajes podría deberse a su capacidad para utilizar almidón o celulosa además de carbohidratos solubles en agua (WSC), porque la expresión de amilasas y de 1–4 y 1–6 glucosidasas en las BAL amilolíticas aisladas de sorgo ha aumentado. ya fue reportado previamente por Velikova et al.44. Muck45 informó que las cepas actuales de L. buchneri son bastante lentas en comparación con las de otras especies. Por lo tanto, otras BAL pueden realizar el trabajo principal de fermentación y, después de la fermentación activa, las cepas de L. buchneri convierten lentamente el ácido láctico en ácido acético. Esto significa que su efecto sobre la estabilidad aeróbica puede tardar un tiempo en observarse, normalmente entre 45 y 60 días después de la fermentación.

En nuestro estudio, el género Lactobacillus representó el 73% y el 51% de la población microbiana en los ensilajes CG-Inoc2 y SG-Inoc2, respectivamente, a los 7 días de fermentación. Los datos del perfil de fermentación de los ensilajes (Tabla complementaria S2) sugieren que la producción de ácido acético por L. buchneri se produjo después de 90 días, principalmente en ensilajes SG-Inoc2. Por lo tanto, podemos especular que otras especies del género Lactobacillus funcionaron como cultivos iniciadores durante la fermentación inicial de estos ensilajes, como lo sugiere Muck45. Aunque P. acidipropionici estaba presente en la composición de Inoc1, curiosamente no se encontraron representantes de este género en los ensilajes de ninguno de los cereales. Estas bacterias propiónicas pertenecen a la clase Actinobacteria, que estaba presente principalmente en la población inicial de CG-Inoc1 y estaba representada por diferentes géneros, incluidos Brevibacterium, Streptomyces y Arthrobacter. Según Filya et al.46, la combinación de P. acidipropionici y L. plantarum no parece prometedora para proteger los ensilajes de trigo, sorgo y maíz de la exposición aeróbica. En general, Propionibacterium ha sido eficaz en situaciones donde la disminución del pH es baja y/o cuando el pH final del ensilaje es relativamente alto (> 4,2–4,5)47, lo que se observó en nuestro estudio, principalmente en ensilajes SG. La ausencia de este género en todas las muestras fue inesperada, particularmente en las muestras recientemente inoculadas (día 0).

Las bacterias que pertenecen al género Weissella son estrictamente heterofermentativas y producen una mezcla de lactato y acetato como principales productos finales del metabolismo del azúcar48,49. Algunas especies se han aislado de una amplia gama de fuentes, como suelo, verduras frescas, carne, pescado, ensilaje fermentado y alimentos50,51,52. De acuerdo con Muck53, quien sugirió que la mayor desviación en la comunidad microbiana parece estar en el ensilaje de maíz en climas cálidos, donde las especies Weissella y Leuconostoc contribuyeron a las primeras etapas de la fermentación, en nuestro estudio, la fermentación de los ensilados CG-CTRL hasta Los 21 días de fermentación también fueron predominantes por Weissella spp. Además, estuvo influenciado por la presencia de este género en los ensilajes SG durante todo el período de fermentación.

Pang et al.54 indicaron que varias Weissella spp. podría mejorar la calidad del ensilaje. Además, Ndagano et al.55 informaron sobre la producción de acetato y otros compuestos antifúngicos, como ácidos grasos 3-hidroxi y fenillactato, por Weissella paramesenteroides aislados de Manihot esculenta fermentada. Sin embargo, Cai et al.56 concluyeron que las cepas heterofermentativas de W. paramesenteroides no mejoraron la calidad del ensilaje y pueden causar cierta pérdida de fermentación debido al mayor crecimiento de bacterias aeróbicas y clostridios, el alto pH, las concentraciones de ácido butírico y nitrógeno amoniacal y las menores concentraciones de ácido láctico. Contenido de ácido en ensilajes de alfalfa y raigrás italiano. El efecto del género Weissella sobre la fermentación del ensilaje aún es contradictorio y poco claro.

Los ensilajes deteriorados a veces se caracterizan por tener niveles elevados de la familia Enterobacteriaceae57. Varias especies, incluidas Salmonella y Escherichia coli, están estrechamente relacionadas con enfermedades humanas y animales. La presencia influyente de Enterobacteriaceae en ensilajes SG estuvo representada principalmente por el género Pantoea, seguido por proporciones menores de Kosakonia. El género Pantoea es un grupo muy diverso cuyos miembros se encuentran en ambientes acuáticos y terrestres y en asociación con plantas, insectos, humanos y animales58. McGarvey et al.32 también informaron que Pantoea es uno de los géneros más comúnmente encontrados en la comunidad bacteriana de la alfalfa. La presencia de este género durante todo el período de fermentación en ensilajes SG contradice los hallazgos de Si et al.13, en los que el género desapareció a los 30 días en ensilaje de alfalfa. Los autores también informaron que estas bacterias se correlacionaban negativamente con las concentraciones de ácido acético y nitrógeno amoniacal y se correlacionaban positivamente con el contenido de WSC. Jacxsens et al.59 informaron que Pantoea agglomerans puede fermentar azúcares a ácidos en condiciones anaeróbicas y también utilizar ácido láctico, provocando pérdida de nutrientes.

La inoculación de ambos granos con Inoc1 resultó en ensilajes dominados por el género Lactobacillus, con mucha menos diversidad que CTRL e Inoc2. Los ensilajes SG-Inoc2 podrían sustentar más Pantoea, Kosakonia y otras enterobacterias que podrían incluir especies de bacterias patógenas. Por tanto, la adición de Inoc1 también puede contribuir a la seguridad de los ensilajes SG.

Una gran cantidad de otros microorganismos indeseables pueden desarrollarse en el ensilaje cuando el pH no se reduce lo suficiente o cuando hay oxígeno disponible. Algunas especies de Bacillus, Clostridium, Listeria, Mycobacterium, Yersinia y Salmonella están asociadas con enfermedades humanas o animales60. Las especies de Pseudomonas y Klebsiella pueden producir aminas biogénicas, que a menudo están relacionadas con una disminución del contenido de proteínas y del valor nutricional del ensilaje61. Entre estos géneros, en nuestro estudio, solo se detectaron Bacillus, Clostridium y Pseudomonas en ambos granos y Mycobacterium en muestras de CG (datos no mostrados). Sin embargo, el número de OTU pertenecientes a estos géneros fue relativamente bajo en todos los ensilajes, lo que refleja las trazas de ácido butírico presentes en los ensilajes (Tabla complementaria S2).

Liu et al.14 también informaron sobre un aumento de la riqueza y diversidad, con una disminución significativa de Firmicutes y un aumento de Proteobacteria en la comunidad bacteriana, en ensilajes de cebada después de una exposición aeróbica prolongada. Por lo tanto, el motivo de los cambios en la comunidad bacteriana a los 360 días en nuestro estudio no está claro porque las condiciones experimentales de anaerobiosis fueron constantes durante todo el período. Además, los estudios que analizan comunidades bacterianas se limitan a períodos de fermentación más cortos, lo que dificulta la correlación de los resultados observados con los de estudios anteriores.

Contrariamente a lo reportado por Dunière et al.60, en los que el ensilaje podía almacenarse por mucho tiempo debido a la acidificación, los cambios en la comunidad final de los ensilajes en ambos granos después de 360 ​​días rompen la premisa de que la comunidad bacteriana se estabiliza luego de una determinada fermentación. período. Esto sugiere que incluso con un pH constante, los cambios en el perfil microbiano de los ensilajes de granos pueden dar lugar a cambios no deseados, como concentraciones más altas de NH3-N y ácido propiónico y recuentos más bajos de LAB, en el perfil de fermentación de los ensilajes almacenados durante mucho tiempo. .

En particular, el perfil del micobioma epífito de los granos antes de la fermentación fue diferente, lo que resultó en diferentes efectos del inoculante microbiano sobre la población de hongos de los materiales ensilados. El predominio de Ascomycota y la presencia de menores cantidades de Basidiomycota y Zygomycota también se observaron en avena marchita, maíz y sus ensilajes31,62,63. Sin embargo, en nuestro estudio, se encontró Mucoromycota en lugar de Zygomycota. Además, Ascomycota y Basidiomycota fueron los principales filos del trébol morado de las praderas (Dalea purpurea Vent.)16.

El grupo Ascomycota es de particular importancia para los humanos como fuente de compuestos medicinales y productos alimenticios, pero también como patógenos para humanos y plantas. Según Romero et al.31, la estabilidad aeróbica aumenta con una abundancia relativa alta de especies de Ascomycota no identificadas en el ensilaje de maíz, lo que sugiere que este microorganismo puede haber limitado el crecimiento de otros microbios responsables del deterioro aeróbico.

Aunque se observó predominio de Ascomycota en todas las muestras, los perfiles de micobioma fueron diferentes entre los granos. El predominio de especies no identificadas de Aspergillus en la muestra de CG, y de Alternaria y otros hongos no identificados pertenecientes al orden Pleosparales en muestras de SG antes de la fermentación, evidenció la alta abundancia de mohos en los granos preensilados incluso sin síntomas visibles de contaminación fúngica. Los mohos pleosporale se asocian típicamente con manchas en las hojas de las plantas. Por lo tanto, se esperaba la presencia de este género porque muchos hongos habitan en la filosfera de las plantas a medida que maduran en el campo y aún pueden estar presentes antes de que se logre la anaerobiosis absoluta62.

La mayoría de los microorganismos fúngicos son estrictamente aeróbicos y algunas especies de Penicillium, Fusarium y Aspergillus permanecen después del procesamiento63. Por lo tanto, en todas las poblaciones microbianas mixtas de ensilajes, ciertas especies, como Aspergillus, Penicillium, Fusarium y Monascus64, se adaptan mejor a una tensión de O2 reducida, un pH más bajo y concentraciones más altas de dióxido de carbono y ácidos orgánicos65.

Según Gulbis et al.66, las especies aisladas con mayor frecuencia del ensilaje de maíz son hongos de los géneros Alternaria, Fusarium y Penicillium. En el presente estudio, Penicillium y Fusarium spp. estuvieron presentes en baja abundancia durante la fermentación del ensilaje. Durante todo el período de fermentación, la fermentación CG estuvo dominada por mohos Aspergillus, mientras que la levadura W. anomalus predominó en las muestras SG. Así, la persistencia y predominio de Aspergillus durante el período de fermentación en ensilajes de CG indican que este género es más tolerante a las condiciones de ensilaje que Alternaria y otros mohos Pleosparal presentes en SG antes de la fermentación.

Aspergillus spp. se distribuye mundialmente y se encuentra entre las especies más predominantes encontradas en diferentes ensilajes en Brasil67. Requiere altas temperaturas y baja actividad hídrica para crecer y puede sobrevivir en ambientes microaerofílicos y ácidos68. Además, las micotoxinas producidas por especies de Aspergillus se encuentran entre las cuatro principales toxinas encontradas en el ensilaje de maíz69. El predominio del género Aspergillus en los ensilajes de CG-Inoc1 desde el inicio de la fermentación sugiere que el inoculante inhibió el crecimiento de algunas levaduras, especialmente la especie Wickerhamomyces. Sin embargo, el aumento en la abundancia de levaduras no identificadas pertenecientes al orden Saccharomycetales en 360 días fue inesperado y el motivo no está claro.

Se sabe que varios factores, incluida la cantidad de aire ingresado durante el almacenamiento del ensilaje y el tipo de cultivo ensilado, afectan la composición de la flora de levadura en el ensilaje70. Como las condiciones anaeróbicas se mantuvieron durante todo el período de fermentación, se sugiere que los diferentes perfiles de la comunidad de levaduras entre los granos pueden verse afectados por el tipo de cultivo y otros factores71. Como se discutió anteriormente, la presencia de algunas levaduras en el ensilaje se asocia con pérdida fermentativa anaeróbica y deterioro aeróbico después de la exposición del ensilaje al aire durante la alimentación de los animales o daños en el sellado del silo70. Además de las pérdidas en la calidad del ensilaje, las levaduras también pueden ser patógenos oportunistas72 que reducen la digestión aparente de fibra detergente neutra in vitro73.

Las levaduras como las especies Wickerhamomyces encontradas en este estudio pertenecen al orden Saccharomycetales y se asocian frecuentemente con el deterioro o el procesamiento de alimentos y productos de cereales. Saccharomycetales spp. también predominan en el microbioma central fúngico de los ensilajes de granos pequeños34. Wickerhamomyces anomalus, anteriormente conocida como Pichia anomala, Hansenula anomala o Candida pelliculosa, fue asignada al género Wickerhamomyces72. Es una especie de levadura biotecnológicamente relevante que está presente en diversos hábitats74. El predominio de esta especie durante la fermentación de ensilajes SG está relacionado con su capacidad para tolerar condiciones ambientales extremas, como estrés oxidativo, salino y osmótico, así como cambios de pH y temperatura75. Sin embargo, debido a estas características, este microorganismo puede causar deterioro en varios productos, incluidos ensilajes y productos lácteos76,77.

Según Druvefors et al.78, W. anomalus es prometedor como alternativa a los fungicidas químicos en el almacenamiento de granos de cereales porque produce metabolitos antifúngicos derivados de la glucólisis, en lugar de la competencia por los nutrientes o la actividad de las enzimas líticas de la pared celular. También se consideran responsables de la actividad antifúngica de esta especie el etanol y el acetato de etilo. En este contexto, aún es necesario dilucidar los efectos de W. anomalus sobre la fermentación del ensilaje.

Los efectos de los inoculantes sobre la sucesión bacteriana y fúngica diferían entre los dos cereales. Lactobacillus y Weissella son las principales bacterias involucradas en la fermentación de ensilajes rehidratados de granos de maíz y sorgo. Aspergillus spp. fueron predominantes en la fermentación de granos de maíz rehidratados, mientras que W. anomalus fue la principal especie de hongo en los ensilajes de granos de sorgo rehidratados. El inoculante que contenía L.plantarum y P. acidipropionici fue más eficiente para promover un fuerte crecimiento de Lactobacillus y mantener una mayor estabilidad de la comunidad bacteriana durante períodos más prolongados de almacenamiento en ensilajes de ambos granos. Además, controló el crecimiento de la levadura Wickerhamomyces hasta los 90 días de fermentación en ensilajes de granos de maíz rehidratados. Las comunidades bacterianas y fúngicas de los ensilajes de granos de maíz y sorgo rehidratados no permanecieron estables después de 360 ​​días de almacenamiento.

Los conjuntos de datos utilizados y/o analizados durante el estudio actual están disponibles en el repositorio del banco de datos Science: https://doi.org/10.57760/sciencedb.02767.

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Agradecemos al Instituto Nacional de Ciencia y Tecnología de la Ciencia Animal (INCT-CA Brasil); Consejo Nacional de Desarrollo Científico y Tecnológico (CNPq); Coordinación de Perfeccionamiento del Personal de Educación Superior (CAPES) y Fundación Minas Gerais de Financiamiento de la Investigación (FAPEMIG) por el apoyo a la investigación.

Falleció Fabyano Fonseca e Silva.

Departamento de Ciencia Animal, Universidad Federal de Vicosa, Avenida PH. Rolfs, Viçosa, Mina Gerais, 36570-900, Brasil

Mariele Cristina Nascimento Agarussi, Odilon Gomes Pereira, Felipe Evangelista Pimentel, Vanessa Paula da Silva & Fabyano Fonseca e Silva

Departament of Statistics, Federal University of Vicosa, Avenida PH. Rolfs, Vicosa, 36570-900, Brazil

Camila Ferreira Azevedo

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MCNA realizó los análisis de laboratorio y preparó el manuscrito. OGP diseñó los experimentos y contribuyó a la redacción del manuscrito. FEP contribuyó a las muestras del experimento. VPS contribuyó a la redacción del manuscrito. CFA y FFS realizaron los análisis estadísticos. Todos los autores revisaron el manuscrito.

Correspondencia a Odilon Gomes Pereira.

Los autores declaran no tener conflictos de intereses.

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Reimpresiones y permisos

Agarussi, MCN, Pereira, OG, Pimentel, FE et al. Microbioma de ensilajes de granos de maíz y sorgo rehidratados tratados con inoculantes microbianos en diferentes períodos de fermentación. Informe científico 12, 16864 (2022). https://doi.org/10.1038/s41598-022-21461-4

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Recibido: 05 de marzo de 2022

Aceptado: 27 de septiembre de 2022

Publicado: 07 de octubre de 2022

DOI: https://doi.org/10.1038/s41598-022-21461-4

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