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Jan 17, 2024

La malato sintasa contribuye a la supervivencia de Salmonella Typhimurium frente a condiciones de estrés oxidativo y nutricional

Scientific Reports volumen 12, Número de artículo: 15979 (2022) Cite este artículo 1168 Accesos 1 Citas Detalles de métricas Para sobrevivir y replicarse en el huésped, S. Typhimurium ha evolucionado varios

Scientific Reports volumen 12, número de artículo: 15979 (2022) Citar este artículo

1168 Accesos

1 Citas

Detalles de métricas

Para sobrevivir y replicarse en el huésped, S. Typhimurium ha desarrollado varias vías metabólicas. La derivación de glioxilato es una de esas vías que puede utilizar acetato para la síntesis de glucosa y otras biomoléculas. Esta vía es una derivación del ciclo del TCA en el que se omiten los pasos de generación de CO2. Dos enzimas implicadas en el ciclo del glioxilato son la isocitrato liasa (ICL) y la malato sintasa (MS). Determinamos la contribución de la EM en la supervivencia de S. Typhimurium en condiciones de estrés oxidativo y limitantes de carbono. La cepa con deleción del gen ms (cepa ∆ms) creció normalmente en medios LB pero no logró crecer en medios mínimos M9 suplementados con acetato como única fuente de carbono. Sin embargo, la cepa ∆ms mostró hipersensibilidad (p < 0,05) al hipoclorito. Además, la cepa ∆ms ha sido significativamente más susceptible a los neutrófilos. Curiosamente, se observó una inducción múltiple del gen ms después de la incubación de S. Typhimurium con neutrófilos. Además, la cepa ∆ms mostró una colonización defectuosa en el bazo y el hígado de las aves. En resumen, nuestros datos demuestran que la EM contribuye a la virulencia de S. Typhimurium al ayudar a su supervivencia en condiciones de falta de carbono y estrés oxidativo.

Según sus presentaciones antigénicas1, los serovares de Salmonella enterica se agrupan en Salmonella tifoidea y no tifoidea (NTS). La OMS reconoce las NTS como una de las tres enfermedades bacterianas transmitidas por alimentos más comunes en humanos en todo el mundo. Las personas mayores, jóvenes e inmunocomprometidas son muy propensas a la infección por Salmonella2. Entre las NTS, el serovar Typhimurium se aísla con mayor frecuencia en pacientes de todo el mundo3.

Después de la ingestión, una proporción de los microorganismos resiste el bajo pH gástrico, invade la mucosa intestinal y se replica en la submucosa y en las placas de Peyer4. Tras la penetración intestinal, S. Typhimurium accede a los ganglios linfáticos mesentéricos, donde las bacterias son fagocitadas por células fagocíticas, como los macrófagos5. Una vez dentro de los macrófagos, S. Typhimurium se compartimenta en una vacuola modificada conocida como “vacuola que contiene Salmonella” (SCV) y representa una característica central en la supervivencia y el crecimiento intracelular de esta bacteria6. Por lo tanto, la absorción por los macrófagos empuja al S. Typhimurium a un medio extraño rico en diversos antimicrobianos y desprovisto de nutrientes clave esenciales para el metabolismo y la replicación. Para sobrevivir en condiciones tan duras, S. Typhimurium modula las funciones de los fagocitos de varias formas. Primero, los efectores codificados por el sistema de secreción tipo III de S. Typhimurium impiden el ensamblaje de la oxidasa fagosómica y, en consecuencia, inhiben la producción de radicales superóxido. En segundo lugar, el SCV actúa como un escudo para S. Typhimurium que no sólo previene la fusión lisosomal sino que también limita la exposición de las células bacterianas contenidas a los agentes antimicrobianos7. Mientras que los antioxidantes primarios de S. Typhimurium apagan directamente los oxidantes, las enzimas reparadoras restauran las funciones de las biomoléculas dañadas8,9.

Sin embargo, la supervivencia contra el ataque antimicrobiano en el fagolisosoma depende de la capacidad del microbio para sintetizar las proteínas y otras biomoléculas necesarias para contrarrestar el estrés. Por lo tanto, un patógeno debe encontrar los nutrientes necesarios para proporcionar los componentes básicos de estas macromoléculas complejas y la energía con la que sintetizarlas10. Es la flexibilidad metabólica de S. Typhimurium la que le permite sobrevivir en condiciones tan duras dentro del huésped11. La capacidad de satisfacer sus necesidades de nutrientes a partir de fuentes alternativas podría desempeñar un papel importante en la capacidad de S. Typhimurium en el huésped. Uno de esos mecanismos de supervivencia es la existencia del ciclo del glioxilato, cuya función principal es permitir el crecimiento bacteriano/celular cuando los compuestos C2, como el etanol y el acetato, son las únicas fuentes de carbono12. Pocos estudios sugieren que los macrófagos sean ricos en ácidos grasos. Tras el metabolismo, los ácidos grasos generan acetil-CoA que puede convertirse en acetato13, un sustrato para el ciclo del glioxilato.

La derivación de glioxilato consta de seis de las ocho reacciones del ciclo del TCA, pero evita los dos pasos oxidativos en los que se desprende dióxido de carbono14. Las dos enzimas únicas del ciclo del glioxilato son la isocitrato liasa (ICL codificada por aceA15) y la malato sintasa (MS codificada por aceB16). Mientras que ICL cataliza la escisión de isocitrato para succinato y glioxilato, MS condensa el glioxilato con un grupo acetilo de acetil-CoA a El resultado neto del ciclo del glioxilato es la producción de malato y succinato a partir de dos moléculas de acetil-CoA derivadas del acetato o la degradación de etanol, ácidos grasos o poli-β-hidroxibutirato17.

Se ha sugerido la contribución potencial del ciclo del glioxilato en la supervivencia de microorganismos bajo estrés oxidativo y su patogénesis. Pocos estudios en patógenos fúngicos y bacterianos han indicado la regulación positiva de los genes del ciclo del glioxilato después de la fagocitosis. Se observa un aumento del flujo metabólico (48%) a través de la derivación de glioxilato en E. coli que experimenta estrés por superóxido18. Un estudio reciente en M. tuberculosis mostró una mayor susceptibilidad de la cepa ms knockdown al estrés oxidativo y nitrosativo, y a los macrófagos19. Se ha sugerido que se requiere ICL para la persistencia de Salmonella durante la infección crónica en ratones20.

Anteriormente, hemos demostrado que la cepa de deleción del gen ms mostró una colonización defectuosa en el ciego de aves de corral9. Además, los residuos de Met de la EM son propensos a la oxidación y pueden repararse con la metionina sulfóxido reductasa. Sin embargo, se desconoce el papel de la EM en la supervivencia de S. Typhimurium en condiciones de estrés oxidativo. En el presente estudio, nuestro objetivo fue explorar la contribución de ms en la supervivencia de S. Typhimurium durante el estrés oxidativo y la colonización en el hígado y el bazo de las aves. Al emplear varias herramientas bioquímicas y de biología molecular junto con cultivos celulares y estudios en animales vivos, demostramos que el ms es necesario para el crecimiento de S. Typhimurium en condiciones de falta de carbono y la supervivencia en condiciones de estrés oxidativo. Finalmente, nuestros datos sugieren que el ms contribuye a la supervivencia de S. Typhimurium en células fagocíticas y en el bazo e hígado de las aves.

La tasa de crecimiento de la cepa Δms fue comparable a la de S. Typhimurium en caldo LB. Sin embargo, la cepa Δms no logró crecer en medio M9 suplementado con acetato como única fuente de carbono (Fig. 1 y Fig. 1 complementaria). Además, observamos la inducción de la proteína malato sintasa en S. Typhimurium cultivado en el medio M9 suplementado con acetato (Figura complementaria 2). La inmunorreactividad de la banda MS fue muy intensa en los lisados ​​​​de S. Typhimurium cultivados en medios mínimos M9 suplementados con acetato en comparación con las bacterias cultivadas en medios con glucosa agregada (Figura complementaria 2a). Sin embargo, la carga en gel SDS fue casi similar para ambas condiciones (Figura complementaria 2b).

La cepa Δms no pudo crecer en acetato como única fuente de carbono: los cultivos de WT y cepas Δms de S. Typhimurium cultivados durante la noche se diluyeron en caldo LB (A) o medio M9 suplementado con 0,4% de glucosa (B) o 0,4% de acetato ( C) y se cultiva en una incubadora con agitación. Las alícuotas se tomaron en un intervalo de 1 h y las densidades ópticas se midieron a 600 nm. Los datos se presentan como media ± DE (n = 3).

Anteriormente, informamos sobre la oligomerización mediada por oxidantes y la formación de Met-SO en la malato sintasa9. Para corroborar nuestros hallazgos, si la malato sintasa es propensa a la oxidación, evaluamos la carbonilación mediante Oxyblot. La carbonilación es un marcador bien aceptado para evaluar la oxidación de proteínas21. Nuestro análisis de Oxyblot mostró una banda mucho más intensa en la malato sintasa expuesta al oxidante en comparación con el control (Figura complementaria 3).

HOCl es uno de los oxidantes más potentes generado por la reacción catalizada por mieloperoxidasa entre H2O2 y iones cloruro. Evaluamos la susceptibilidad de la cepa Δms al HOCl. Se encontró que el porcentaje de recuperación de la cepa Δms se redujo hasta un 9,39% y un 0,013% en comparación con el 42,31% y el 0,141% en el caso de WT después de tratar las células con HOCl 1,5 y 3 mM respectivamente (Fig. 2). .

La cepa Δms de S. Typhimurium es hipersensible al HOCl: las cepas WT y Δms de S. Typhimurium se cultivaron en caldo LB hasta la fase estacionaria tardía. Luego, los cultivos se expusieron a las concentraciones indicadas de NaOCl durante 2 h. Después de la exposición, los cultivos se diluyeron en serie y se sembraron en placas HEA. Las colonias se enumeraron tras la incubación de las placas, expresadas en porcentaje de células viables recuperadas. Los resultados se muestran como media ± SE (n = 3) y son representativos de dos experimentos. *p < 0,05.

Los neutrófilos son las células productoras clave de HOCl. Después de observar la susceptibilidad de la cepa Δms al reactivo HOCl, investigamos el papel del gen ms en la supervivencia de S. Typhimurium contra la muerte mediada por neutrófilos. Los neutrófilos se incubaron con cepas WT o Δms de S. Typhimurium. Mediante siembra retrospectiva, la MOI observada para las cepas WT y Δms fue 1:7 y 1:8,5 (neutrófilos: bacterias), respectivamente. Después de 15 minutos de incubación, se encontró que el porcentaje de recuperación de la cepa Δms se redujo hasta un 8,47% en comparación con el 16,42% en el caso de WT después de la incubación con neutrófilos (Fig. 3). De hecho, la cepa Δms fue significativamente más susceptible (p <0,0001) a la muerte mediada por neutrófilos.

La cepa Δms muestra hipersensibilidad a los neutrófilos: los neutrófilos se infectaron con cepas WT y Δms de S. Typhimurium @ MOI de 10:1 (bacterias:células). Después de 15 minutos de incubación, los neutrófilos fueron lisados ​​por Triton X-100. Los lisados ​​se diluyeron en serie y se sembraron en placas de agar HE. Las colonias se contaron tras la incubación de las placas. Se muestra la comparación del porcentaje de cepas WT y Δms recuperadas de S. Typhimurium después de 0 min y 15 min después de la infección. Los datos se presentan como media ± SE (n = 5). ****p < 0,0001.

Después de observar la hipersusceptibilidad de la cepa Δms a los neutrófilos, evaluamos la expresión de ms después de la incubación de S. Typhimurium con neutrófilos. S. Typhimurium se cultivó conjuntamente con neutrófilos durante 15 minutos y la expresión relativa del gen ms se analizó mediante qRT-PCR. Observamos una regulación positiva de 3,82 veces de ms en S. Typhimurium después de la incubación con neutrófilos (Figura complementaria 6).

Las aves de corral son uno de los reservorios más importantes de S. Typhimurium en la naturaleza, que transmite la infección a través de los huevos y la carne. Después de una breve fase entérica, S. Typhimurium ingresa al bazo y al hígado, donde se dirige a varias células fagocíticas. Determinamos las cargas bacterianas en el bazo y el hígado de las aves los días 7, 14 y 21 después de la infección. En el bazo de aves infectadas con la cepa WT, obtuvimos bacterias en todo momento después de la infección. Los números de S. Typhimurium recuperados a los 7, 14 y 21 días se expresaron en log10 UFC/bazo (media ± SE). El número de cepas WT recuperadas fue 1,4 ± 0,36, 1,3 ± 0,61 y 0,6 ± 0,37 respectivamente. Sin embargo, la supervivencia de la cepa ∆ms se vio comprometida en el bazo y recuperamos bacterias mutantes solo hasta 14 días después de la infección. Los recuentos fueron 0,58 ± 0,36 y 0,64 ± 0,4 los días 7 y 14 respectivamente (Fig. 4).

Cuantificación de la carga bacteriana en el bazo tras la infección oral de aves con cepas WT o Δms de S. Typhimurium: el bazo se homogeneizó en PBS estéril y se sembraron 100 µl de homogeneizado en placas HEA. Las UFC por bazo se calcularon después de 7 y 14 días después de la infección (dpi). Los datos se presentan como media ± SE (n = 5). *p < 0,05.

En el hígado, recuperamos bacterias de aves infectadas con cepas WT y ∆ms hasta 14 días después de la infección y expresamos los valores como log10 UFC/g de hígado (media ± SE). El número de bacterias WT recuperadas fue de 0,86 ± 0,5 y 2,37 ± 1,0 a los 7 y 14 días después de la infección, respectivamente. En aves infectadas con la cepa ∆ms, recuperamos 0,4 ± 0,4 y 0,4 ± 0,4 el día 7 y 14 después de la infección, respectivamente (Fig. 5). 14 días después de la infección, las cargas bacterianas en el hígado de las aves infectadas con la cepa ∆ms fueron significativamente (p <0,05) más bajas que las del grupo infectado con WT.

Análisis de la carga bacteriana en el hígado tras la infección oral de aves con cepas WT o Δms de S. Typhimurium: el hígado (100 mg) se homogeneizó en PBS estéril y se sembraron 100 µl de homogeneizado en placas HEA. Las UFC por gramo de hígado se calcularon después de 7 y 14 días después de la infección (dpi). Los datos se presentan como media ± SE (n = 5). *p < 0,05.

Para prosperar dentro del huésped, S. Typhimurium tiene que enfrentarse al entorno de las células fagocíticas que limita los nutrientes/carbono y es rico en oxidantes. Para evaluar el papel del ciclo del glioxilato en S. Typhimurium bajo estas dos condiciones de estrés (falta de carbono y oxidativo), eliminamos el gen de la malato sintasa y confirmamos la eliminación mediante PCR9. La cepa Δms creció normalmente en medios LB o medios mínimos M9 suplementados con glucosa (Fig. 1A, B y Fig. 1 complementaria). Sin embargo, la cepa Δms mostró un defecto de crecimiento total cuando se cultivó en medio mínimo M9 suplementado con acetato como única fuente de carbono (Fig. 1C y Fig. 1 complementaria).

Se ha informado de la inducción de enzimas de derivación de glioxilato en S. Typhimurium cultivado en medios que contienen acetato22. Observamos una inducción enorme (más de 20 veces) de la proteína malato sintasa en S. Typhimurium cultivado en medio mínimo M9 suplementado con acetato en comparación con el cultivo en medio mínimo M9 suplementado con glucosa (Figura complementaria 2). Estos datos sugieren un papel fundamental de la malato sintasa en la supervivencia de S. Typhimurium en condiciones limitantes de carbono.

Bajo estrés oxidativo, la activación de las enzimas de la derivación de glioxilato se ha observado en varios microorganismos, incluidos Pseudomonas aeruginosa23, M. tuberculosis24, Alishewanella25 y Acinetobacter oleivorans26. El análisis bioinformático sugiere que los microorganismos en los que el ciclo del glioxilato es funcional son aeróbicos o anaeróbicos facultativos23. El uso de oxígeno para oxidar nutrientes y obtener energía a través de la respiración genera superóxidos, peróxido de hidrógeno y radicales hidroxilo altamente reactivos18. Por lo tanto, los microorganismos encuentran niveles potencialmente letales de estas ROS debido al estallido oxidativo de los fagosomas, así como a su metabolismo aeróbico normal27. De hecho, el NADH sirve principalmente para la generación de ATP, sin embargo, su oxidación durante la respiración aeróbica es responsable de la generación de la mayor parte de las ROS28 endógenas. El aumento del flujo de metabolitos a través de la derivación de glioxilato en lugar del ciclo de TCA reduce la cantidad de producción de NADH a partir de glucosa. La reducción en la generación de NADH disminuye las ROS totales ya que los superóxidos generados a partir del metabolismo celular serán mínimos18. Además, a diferencia de los eucariotas, la isocitrato deshidrogenasa (IDH) de las bacterias que son capaces de crecer en acetato está ligada a NADP en lugar de a NAD. Durante el estrés oxidativo, el NADH funciona como el principal reductor de nucleótidos de nicotinamida28. Debido a la mayor reactividad con Fe3+ generada por la reacción de Fenton, los niveles de NADH se agotan rápidamente en comparación con los de NADPH. De acuerdo con la hipótesis anterior, E. coli estresada con paraquat mostró una mayor producción de acetato y flujo en el ciclo del glioxilato, en consecuencia, aumentó la relación NADPH:NADH18. Por lo tanto, la dependencia de NADP de las IDH bacterianas parece ser una adaptación para crecer en acetato en la que el ciclo del glioxilato disminuye el nivel de NADH sin poner en peligro su regulación positiva por la fosforilación de IDH mediada por NADP. Estos interesantes conocimientos indican la contribución potencial del ciclo del glioxilato en la supervivencia de microorganismos bajo estrés oxidativo.

Esto nos llevó a examinar el efecto de la eliminación del gen ms en la supervivencia de S. Typhimurium tanto en condiciones de falta de carbono como de estrés oxidativo. Para imitar estas dos condiciones, expusimos células privadas de nutrientes (crecidas hasta la fase estacionaria tardía) a HOCl. La cepa Δms ha sido más susceptible (p <0,05) al HOCl en comparación con la cepa WT de S. Typhimurium (Fig. 2), lo que sugiere un papel importante del ciclo de malato sintasa/glioxilato en la supervivencia de S. Typhimurium bajo estrés oxidativo. La cepa de P. aeruginosa con deleción del gen malato sintasa mostró hipersusceptibilidad al paraquat, un oxidante químico23. Un estudio diferente demostró la hipersensibilidad de mutantes de P. aeruginosa en las enzimas del ciclo del glioxilato al H2O229.

Los neutrófilos son las células productoras clave de HOCl. Así, evaluamos el papel de ms en la supervivencia de S. Typhimurium frente a neutrófilos. En comparación con la cepa WT de S. Typhimurium, la cepa Δms ha sido altamente susceptible (p <0,0001) a los neutrófilos (Fig. 3). Las enzimas del ciclo del glioxilato contribuyen a la supervivencia de diversos patógenos frente a las células fagocíticas. La cepa deficiente en icl de Rhodococcus equi30, la cepa inactivada de M. tuberculosis19 mostró una supervivencia defectuosa después de la exposición a células fagocíticas.

Después de observar la hipersusceptibilidad de la cepa Δms a los neutrófilos, nos preguntamos si el gen ms se induce después de la incubación de S. Typhimurium con fagocitos. De hecho, observamos una inducción de 3,82 veces de malato sintasa después de la incubación de S. Typhimurium con neutrófilos. Se ha observado una regulación positiva de los genes del ciclo del glioxilato después de la fagocitosis en hongos patógenos como Paracoccidioides brasiliensis31, Penicillium marneffei32, Aspergillus fumigatus33, Cryptococcus neoformans34 y Candida albicans35, así como en varios patógenos bacterianos como P. aeruginosa36, M. tuberculosis (Muñoz-Elias y McKinney 2005). ) y R. equi30. Los microorganismos atrapados dentro del precario nicho de los fagolisosomas necesitan utilizar fuentes de carbono disponibles para sobrevivir en condiciones de limitación de nutrientes y otras condiciones de estrés. Los fagocitos son ricos en ácidos grasos que podrían inducir la activación de las enzimas del ciclo del glioxilato en el fagosoma37. Un estudio sugirió la importación de ácidos grasos derivados de triacilgliceraldehídos (TAG) del huésped en M. tuberculosis38. Además, en S. Typhimurium, se ha demostrado que los genes para el metabolismo de los lípidos y el ciclo del glioxilato son esenciales para la colonización en tejidos de ratón como el ciego, las placas de Peyer, los ganglios linfáticos mesentéricos, el bazo y el hígado39. En un experimento de cocultivo con macrófagos, se descubrió que los genes para la importación de lípidos, la β-oxidación y el ciclo del glioxilato eran necesarios para la supervivencia de S. Typhimurium39. Por lo tanto, una posibilidad intrigante de generación de compuestos simples dentro de los fagocitos puede ser proporcionada por la descomposición de los ácidos grasos mediante β-oxidación, lo que da como resultado acetil-CoA, un sustrato para el ciclo del glioxilato10.

En el pollo, se produce una amplia multiplicación bacteriana en el ciego40. Después de eso, las bacterias llegan al sistema reticuloendotelial41 y finalmente al bazo, el hígado y la médula ósea. Anteriormente, hemos demostrado que la malato sintasa contribuye a la colonización de S. Typhimurium en el ciego de aves de corral9. El bazo y el hígado son órganos importantes implicados en las respuestas inmunitarias contra S. Typhimurium41. Se ha sugerido que la replicación de S. Typhimurium en el SCV de un solo fagocito, ya sea en el hígado o en el bazo, es limitada durante la infección aguda42; sin embargo, el número de bacterias en el hígado aumenta al propagarse de uno a otros fagocitos cercanos, formando así un foco de infección43. Así, aunque S. Typhimurium crece mal en los fagocitos infectados, crece en grandes cantidades en los numerosos focos del hígado43. Estas observaciones sugieren que la disponibilidad de sustrato metabólico en el fagosoma puede evolucionar durante el curso de la infección, con una dependencia cada vez mayor de la utilización de ácidos grasos y acetatos durante la infección crónica. S. Typhimurium modula las funciones esplénicas de tal manera que el bazo sirve como refugio seguro para esta bacteria44,45. A continuación, evaluamos la contribución de la malato sintasa en la supervivencia de S. Typhimurium en el bazo e hígado de aves. La diseminación de la cepa Δms al bazo (p <0,001) y al hígado (p <0,01) fue menor que la de la cepa WT de S. Typhimurium (Figs. 4 y 5). La participación de icl como determinante de virulencia se ha observado en diversos organismos patógenos como M. tuberculosis (Muñoz-Elias y McKinney 2005), R. equi30 y P. aeruginosa36. En S. Typhimurium, se requiere icl para la infección crónica, pero no para la infección letal aguda en ratones20.

Para sobrevivir dentro del huésped, los patógenos bacterianos, incluido S. Typhimurium, deben tener una serie de sistemas de respuesta para el manejo del estrés. La existencia de varias vías metabólicas proporciona flexibilidad metabólica que ayuda en la utilización de diversos metabolitos/sustratos disponibles en un nicho particular. Se ha demostrado que el ciclo completo del ácido tricarboxílico (TCA) opera durante la infección de ratones con S. Typhimurium46. La vía glucolítica es necesaria para la replicación intracelular de S. Typhimurium en ratones y macrófagos y la glucosa es el principal azúcar utilizado por S. Typhimurium durante la infección de macrófagos47. Por lo tanto, para reponer la glucosa y otros intermediarios del ciclo de los TCA durante condiciones de estrés y limitación de nutrientes, el ciclo del glioxilato desempeña un papel fundamental para proporcionar la energía necesaria para replicarse y sobrevivir dentro del huésped.

Estas observaciones sugieren que la disponibilidad de sustrato metabólico en el huésped puede evolucionar durante el curso de la infección, con una dependencia cada vez mayor de la utilización de ácidos grasos y acetatos durante la infección crónica. Específicamente, estas enzimas podrían agregar flexibilidad metabólica potencial al metabolismo redox al desacoplar efectivamente el flujo de carbono catabólico de la formación de NADPH que ocurriría en paralelo con el ciclo del ácido tricarboxílico. Por lo tanto, en el caso de S. Typhimurium, las enzimas centrales del ciclo del glioxilato podrían ser necesarias durante diferentes etapas para cumplir con sus requisitos metabólicos y energéticos48 y ayudar en su supervivencia en condiciones de estrés oxidativo.

Todos los experimentos con animales fueron aprobados por el Comité Institucional de Ética Animal (IAEC), Consejo Indio de Investigación Agrícola-Instituto Indio de Investigación Veterinaria (ICAR-IVRI), Izatnagar, India con el expediente de aprobación No. F.1.53/2012-13-JD ( Res). Todos los experimentos con animales se realizaron de acuerdo con las directrices y regulaciones de la IAEC, ICAR-IVRI, Izatnagar, India.

Salmonella enterica subespecie enterica serovar Typhimurium cepa 5591 (S. Typhimurium), un aislado de aves de corral, se obtuvo del depósito del Centro Nacional Veterinario de Salmonella, Instituto de Investigación Veterinaria de la India (IVRI), Izatnagar, India. La cepa mutante por deleción del gen ms en S. Typhimurium (cepa ∆ms) se curó como se describió anteriormente9 y se confirmó mediante PCR. Los medios bacteriológicos como el agar Luria Bertani (LB), el caldo LB y el agar entérico Hektoen (HEA) se adquirieron de HiMedia Laboratories Pvt. Limitado. Ltd., Bombay, India. La solución salina equilibrada de Hank (HBSS) se preparó según el protocolo estándar49.

Se inocularon colonias aisladas de cepas de S. Typhimurium y ∆ms en 10 ml de caldo LB y se cultivaron a 37 °C con agitación a 180 rpm. Los cultivos cultivados durante la noche se diluyeron (@ 1:100) en 50 ml nuevos de medio LB y se cultivaron en una incubadora con agitación. Se retiraron alícuotas cada una hora de intervalo y se midieron las densidades ópticas a 600 nm.

El crecimiento de las cepas de S. Typhimurium y Δms también se evaluó en medios mínimos M9 suplementados con acetato o glucosa como única fuente de carbono. Brevemente, se sedimentaron cultivos cultivados con LB durante la noche y se lavaron con medio mínimo M9. Luego, los sedimentos lavados se cultivaron en medio M9 suplementado con acetato al 0,4 % o glucosa al 0,4 %.

Se expusieron cultivos de cepas de S. Typhimurium y ∆ms cultivados durante la noche a diversas concentraciones de HOCl (hipoclorito de sodio, NaOCl, Sigma). Después de 2 h de incubación a 37 °C/180 rpm, los cultivos se diluyeron en serie y se sembraron en placas HEA. Las colonias se contaron después de la incubación de las placas durante la noche.

Los neutrófilos se aislaron como se describe en otra parte50 con modificaciones menores. Los ensayos de susceptibilidad se realizaron según el protocolo de Okamura y Spitznagel51 con modificaciones menores. En resumen, la sangre se extrajo de la vena yugular de cabras adultas sanas en un vacutainer recubierto de EDTA. Los neutrófilos se aislaron mediante un método de centrifugación de doble densidad utilizando Histopaque 1119/1077 (Sigma-Aldrich, EE. UU.). Las células se lavaron dos veces con solución salina tamponada con fosfato y una vez con HBSS sin sales de Ca2+/Mg2+ (HBSS -) a 250 xg durante 10 min. El número total de células viables se enumeró mediante el método de exclusión del tinte azul tripán y se ajustó a una concentración de 2 × 106 células/ml utilizando medio HBSS (–). Los cultivos de crecimiento medio de las cepas de S. Typhimurium y ∆ms se sedimentaron, se lavaron y se suspendieron en HBSS. Las suspensiones de neutrófilos y bacterias se mezclaron con una multiplicidad de infección (MOI) de 1:10 (célula:bacteria). La mezcla se incubó durante 15 min a 37 °C y 5% de CO2 en una cámara humidificada. Para determinar la MOI real, las suspensiones bacterianas se diluyeron en serie y se sembraron en medios de agar. Después de 15 minutos de incubación de neutrófilos y bacterias, las suspensiones se centrifugaron a 13.000 rpm durante 3 minutos. Se descartó el sobrenadante y el sedimento se lisó con Triton X-100 al 0,1 % durante 5 min. Los lisados ​​se diluyeron en serie y se sembraron en placas HEA. Las colonias se contaron después de la incubación de las placas durante la noche.

El análisis de expresión del gen ms se realizó mediante qRT-PCR. Los neutrófilos se infectaron con S. Typhimurium durante 15 minutos como se describe en la sección anterior. El ARN del sedimento recolectado se aisló mediante reactivo Trizol. El ARN aislado de cultivos cultivados en caldo LB sirvió como control. qRT-PCR se realizó de acuerdo con el protocolo descrito en el kit de síntesis de ADNc Maxima H Minus First Strand (Thermo Scientific). En resumen, para una reacción de 20 µl, se mezclaron 500 ng de ARN con 1 µl de cebador aleatorio (100 pmol), 1 µl de mezcla de dNTP (10 mM), 4 µl de tampón RT 5X y 1 µl de Maxima H. Menos mezcla de enzimas. El ADNc se sintetizó mediante incubación de la mezcla anterior a 25 °C durante 10 min, seguido de 50 °C durante 15 min y terminación a 85 °C durante 5 min. Los niveles de expresión del gen ms en cada muestra se evaluaron y normalizaron utilizando ADN girasa B (gyrB) como control interno52. Para una reacción de qRT-PCR de 20 µl, se utilizaron 0,5 µM de cada cebador, 2 µl de ADNc y 10 µl de SYBR Green (Thermo Scientific). El cambio relativo en la expresión génica se determinó utilizando el método 2-ΔΔCT53. La desnaturalización inicial se llevó a cabo a 95 °C durante 5 min, seguida de 40 ciclos que consistieron en desnaturalización a 95 °C durante 10 s, recocido a 62 °C durante 30 s y adquisición de datos a 74 °C durante 30 s. Los productos amplificados se analizaron en gel de agarosa al 1,5% para evaluar la amplificación no específica (si la hubiera) y los dímeros del cebador.

Todos los experimentos se llevaron a cabo de acuerdo con las pautas del Comité de Ética Animal del Instituto, ICAR-IVRI, Izatnagar, India y de acuerdo con las pautas de ARRIVE. Las cargas bacterianas en el hígado y el bazo se evaluaron como se describió anteriormente54. En resumen, se adquirieron polluelos de un día de edad del ICAR-Central Avian Research Institute (CARI), Izatnagar, India, y se les proporcionó alimento y agua ad libitum. Las aves fueron examinadas para detectar la presencia de Salmonella spp. Las aves libres de Salmonella se dividieron en dos grupos y se infectaron oralmente con la cepa S. Typhimurium o Δms. Después de 7, 14 y 21 días después de la infección, se sacrificaron 5 aves de cada grupo. Se homogeneizaron 100 mg de hígado y bazo completo en 1 ml de PBS. Se sembraron 100 µl de muestras homogeneizadas en placas HEA. Las placas se incubaron durante la noche a 37 °C.

El estado de oxidación de la malato sintasa se evaluó mediante el kit de detección de oxidación de proteínas OxyBlot™ (EMD Millipore). La malato sintasa se purificó y se incubó con H2O2 100 mM como se describió anteriormente9. El exceso de H2O2 se eliminó mediante diálisis. Se desnaturalizaron concentraciones variables (2, 1, 0,5 μg) de las muestras de malato sintasa expuestas a H2O2 con SDS al 6% (final) y se derivatizaron con 2, 4-dinitrofenhidrazina (DNPH). Luego, las muestras derivatizadas se resolvieron en gel de SDS al 10 % y se electrotransfirieron sobre la membrana de nitrocelulosa. Después del bloqueo, la transferencia se incubó en anticuerpos anti-DNPH y se desarrolló como se menciona en un protocolo descrito en otra parte55.

S. Typhimurium se cultivó en medio mínimo M9 suplementado con glucosa o acetato. Los cultivos cultivados en fase estacionaria tardía se sedimentaron y se lavaron con PBS enfriado con hielo. Luego, los sedimentos se lisaron con BugBuster Master Mix (EMD Millipore Corp, EE. UU.) y las células intactas se eliminaron mediante centrifugación. Las proteínas totales en los sobrenadantes clarificados se estimaron mediante el kit de ensayo de proteínas Pierce BCA (Thermo Scientific, EE. UU.). Se resolvieron quince microgramos de lisados ​​​​libres de células en gel SDS y se transfirieron a membranas de PVDF. Después del bloqueo, las membranas se incubaron con sueros hiperinmunes anti-MS (diluciones 1:50.000 en PBS-Tween 20). Después del lavado, la membrana se lavó en IgG anti-conejo conjugada con fosfatasa alcalina (Sigma, a una dilución de 1: 15.000 en PBS-Tween 20) y se reveló utilizando NBT y BCIP como sustrato9.

La representación gráfica de los datos se realizó mediante el uso del software Microsoft Excel y el análisis de los resultados se realizó mediante análisis de varianza unidireccional (ANOVA).

Todos los datos generados o analizados durante este estudio se incluyen en este artículo publicado [y sus archivos de información complementaria].

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Descargar referencias

Este trabajo fue financiado por el Departamento de Biotecnología de la India (Subvención No.: BT/PR13689/BRB/10/1399/2015) y NASF, ICAR, India (Subvención No.: NFBSFARA/BS-3012/2012-13 ). Los financiadores no tienen ningún papel en el diseño del estudio, la recopilación y análisis de datos, la decisión de publicar o la preparación del manuscrito. Agradecemos a nuestro Director, ICAR-Instituto Indio de Investigación Veterinaria (IVRI) por proporcionar las instalaciones necesarias. Ratanti Sarkhel agradece el apoyo del ICAR y del Consejo Indio de Investigación Médica (ICMR-SRF), India.

División de Bioquímica, ICAR-Instituto Indio de Investigación Veterinaria, Izatnagar, 243122, India

Ratanti Sarkhel, Shekhar Apoorva, Swagatika Priyadarsini, Hari Balaji Sridhar, Sanjeev Kumar Bhure y Manish Mahawar

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RS, SA, HBS y SP realizaron los experimentos. RS, SKB y MM realizaron el análisis y escribieron el artículo. Todos los autores revisaron el manuscrito.

Correspondencia a Manish Mahawar.

Los autores declaran no tener conflictos de intereses.

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Sarkhel, R., Apoorva, S., Priyadarsini, S. et al. La malato sintasa contribuye a la supervivencia de Salmonella Typhimurium frente a condiciones de estrés oxidativo y nutricional. Informe científico 12, 15979 (2022). https://doi.org/10.1038/s41598-022-20245-0

Descargar cita

Recibido: 11 de enero de 2022

Aceptado: 12 de septiembre de 2022

Publicado: 25 de septiembre de 2022

DOI: https://doi.org/10.1038/s41598-022-20245-0

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